细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)

产品内容

产品简介

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8），是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测的试剂盒。

CCK-8试剂中含有WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐）是一种类似于MTT的化合物，它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸-二甲酯（1-Methoxy PMS）存在条件下，可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan （参考图1），生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。

操作步骤

• 制作标准曲线（测定细胞具体数量时）

1. 制备细胞悬液：细胞计数。

2. 接种到 96 孔板中：按比例（例如：1/2 比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 3-5 个细胞浓度梯度，每组 3-6 个重复孔。每孔约 100μl 细胞悬液。

3. 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时，如果不需要贴壁，这

   ^{步可以省去。}

1. 每孔加入 10μl CCK-8 增强型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡，以免影响吸光度的检测。

2. 培养箱内孵育一定时间后测定 450nm 吸光度，制作出一条以细胞数量为横坐标(X

   轴)，吸光度为纵坐标(Y 轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入 CCK-8 后的培养时间。）

• 细胞活性检测

1. 制备细胞悬液：细胞计数。

2. 接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约 100μl 细胞悬液，可设置 3 个

   重复孔。

3. 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 2-4 小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4. 每孔加入 10μl CCK-8 增强型溶液：由于每孔加入 CCK-8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK-8 的培养基，以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡，以免影响吸光度的检测。

5. 培养箱内孵育 0.5-4 小时：细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样，对于大多数情况孵育 1 小时即可。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 小时）。

6. 测定 450nm 吸光度：如果暂时不测定吸光度，可以向每孔中加入 10μl CCK-8 反应终止液，遮盖培养板避光保存在 2-8℃，在 7 天内吸光度不会发生变化；或者可以向每孔中加入 10μl 自己配制的 0.1M HCl 溶液或 1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条

   件下，在 24 小时内吸光度不会发生变化。