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上海恒远重点分析如何选择一抗二抗
点击次数:213 发布时间:2018-03-07

    根据我公司技术员的总结了解,不少客户对一抗、二抗的选择方面甚是苦恼,您是否也正面对此问题而不知怎样做呢?在今天的内容里,上海恒远重点分析。

        

    通常情况下,某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择,如何能选择到zui适合该实验的二抗,需要综合以下几个方面进行考虑:
    *、一抗的物种来源
    一抗是在什么物种来源的,相应的二抗也要是抗该物种的抗体。例如,如果一抗是在小鼠体内制备的,那么你就应当选择抗小鼠的二抗,如果一抗是在兔体内制备的,那么二抗就应当是抗兔的抗体。至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。

第二、一抗是属于哪个类或亚类
    二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.

    单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗体。

    如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。

    如果您不知道一抗是哪一类别或亚类,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。

下面总结了几种具有不同特异性的二抗:
    针对整个抗体分子(H+L)具有特异性:如anti-IgG(H+L),此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合,即与抗体分子的 Fc,F(ab’)2/Fab部分均可反应,anti-IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应,因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链。

    针对Fab片段具有特异性:这类抗体与重链轻链均可以结合,由于它们可以与轻链反应,它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。

    这对Fc片段或重链具有特异性:这类抗体和重链的Fc部分反应,一次它们是类别特异性的(即gamma链特异性抗体只与IgG反应,mu链特异性抗体只识别IgM,依此类推)。

    轻链特异性:与所有类别的抗体反应,因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。

    经过吸附处理的二抗:不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景。例如,如果是小鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。

         
    第三、选择哪种形式的二抗,是整个IgG分子,F(ab’)2片段,还是Fab片段?整个IgG分子:此种抗体适用于多数情况。
    F(ab’)2片段:该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成,这些抗体用在特定的情况中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。

    Fab片段:它们只有一个结合位点,一般用来封闭内源性免疫球蛋白。
第四、选用耦联有哪种探针的二抗?
    一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于western blot和ELISA,zui常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。

第五、抗体的纯度:
    亲和层析纯化的抗体一般更受人们欢迎,因为这些产品的纯度zui高,产生的非特异性背景zui少。但是有些情况下也要考虑到纯化过程中损失的IgG部分,因为其中含有亲和力很高的抗体,尤其是当目的抗原存在的量很小的时候,高亲和性的IgG部分就显得尤为重要。

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