人螺旋肽

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英文名称：Human triple-helical peptide,THP ELISA KIT      
产品规格：96T/48T        
品牌：RD/RB/IBL        
类别：ELISA试剂盒/人的ELISA检测试剂盒      
产品特点：For laboratory use only,Not for drug or other uses.本公司可提供免费代测服务.      
上海恒远供应“名称”备有现货，有需要的请及时垂询   
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业　务
操作步骤
     方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O?D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O?D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：　　　
1、用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
2、次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。同时做空白、阴性及阳性孔对照于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,zui后一遍用DDW（超纯水）洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
3.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
4.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
5.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O?D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O?D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
试剂器材
　　1.　试剂
　　（1）　包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）:
　　　　NaCO31.59克　NaHCO3　 2.93克　　加蒸馏水至1000ml　　
    （2）　洗涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4?12H2O　2.9克　NaCl  8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
　　（3）　稀释液:牛血清白蛋白（BSA） 0.1克　加洗涤缓冲液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清与洗涤液配成5～10％使用。
　　（4）　终止液（2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。
　　（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:0.2M Na2HPO4（28.4克／L） 25.7ml　0.1M 柠檬酸（19.2克／L） 24.3ml　加蒸馏水50ml。
　　（6）　TMB（四甲基联苯胺）使用液:TMB（10mg／5ml无水乙醇） 0.5ml底物缓冲液（PH5.5） 10ml0.75％H2O2　32μl
　　（7）　ABTS使用液:ABTS　0.5mg　底物缓冲液（PH5.5） 1ml　3％H2O2　2μl
　　（8）　抗原、抗体和酶标记抗体。
　　（9）　正常人血清和阳性对照血清。
　　2.　器材:
　　（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
　　（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
　　（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。
注意事项
　　1.　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。
　　2.　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
　　（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
　　（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的zui适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值zui大而蛋白量zui少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
　　（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
　　（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

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