RD试剂盒说明结合物的制法与保存

    我们今天来分析ELISA试剂中相关结合物的问题，这是昨天下午一个来自上海的老师提出来的，做酶标记抗体的制备，要说方法主要的来看一共是有两种。RD试剂盒说明结合物的制法与保存，下面我们来细致的了解一下。
    我们刚才说到了主要的两种方法，先来看*种，戊二醛交联法。        
    戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊 二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效（结合率达60%-70%）和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结 合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先 将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比 例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较 一步法低。 
    方法二：过碘酸盐氧化法
    本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，在这上海恒远生物说明一下，的比例是：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRPzui可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。  
    看完了两种制法之后，我们来进一步的分析，理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中zui后的酶活性测定，因经过*洗涤，游离酶可被除去，并不影响zui终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法zui为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。
    用离子交换层析或分子筛分离更为可取，液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得*的分离效果，但费用较贵。 
    结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。zui适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的*灵敏度，达到zui合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的zui高稀释度。上海恒远生物给您举个例子吧，我们比如说某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的zui适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行“滴配”选择能达到高敏感度的zui大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。 
结合物的保存 
    酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素和防腐剂，以防止细菌生长。 
    到这里本文就基本结束了，上海恒远生物是专业供应RD试剂盒的，您在其中有疑问都可以来电给我公司何，我们公司的技术人员来为您探讨分析。