恒远总结人胎球蛋白A实验全过程详解

　　人胎球蛋白A检测试剂盒实验全过程详解
　　
　　预期用途
　　
　　此试剂盒可用于血清，血浆，细胞上清，组织提取物和尿液中人胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白的定量的检测；血清或血浆中胎球蛋白A的检测可作为某些癌症及基因遗传缺陷的血清蛋白诊断的辅助工具；此试剂盒仅供实验室专业人士使用
　　
　　简介
　　
　　胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白，是由两个氨基末端抑制域和一个较小的羧基末端域组成的59kDa分子量的糖蛋白；由肝脏合成，分泌至血流，成年哺乳动物体内的浓度范围在0.5-1.0g/L；婴儿期的血清胎球蛋白A含量高，参与蛋白酶抑制活性，与钙代谢和骨调节相关；累积于骨和牙齿内，作为生物学上非胶原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂；干涉钙盐沉淀；近期研究显示低水平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物；另外，高胎球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物
　　
　　实验原理
　　
　　此试剂盒可用于血清样本中人胎球蛋白A的定量检测；采用双位点夹心法，羊抗人胎球蛋白A多抗结合人胎球蛋白A的不同位点
　　
　　将含人胎球蛋白A的试验标准品，质控品和预稀释样本加至包被了高度亲和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔内，*次孵育，包被抗体捕获样本中的人胎球蛋白A，未结合的蛋白洗板除去，然后加入HRP标记的抗人胎球蛋白A酶联物加入至每孔，“夹心-人胎球蛋白A-HRP-标记的酶联物”形成夹心，未结合的示踪抗体通过洗板除去，结合于包被板上的HRP酶免物与底物液定时反应，然后在酶标仪上检测；结合于包被胎球蛋白A上示踪抗体酶活性与样本中胎球蛋白A的含量直接相关，在点对点或三次回归模式下以标准品的浓度比上OD值绘制标准曲线，样本中的胎球蛋白A可直接从标准曲线上得到
　　
　　试剂：准备与贮存
　　
　　此试剂盒收到后立即贮存于2-8℃下，效期见试剂盒标签；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
　　
　　使用前，所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能交换使用
　　
　　包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗体；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥剂的铝箔密封袋内；贮存于2-8℃至有效期
　　
　　胎球蛋白A示踪抗体，1瓶，0.6ml，浓缩，HRP标记的抗人胎球蛋白A示踪抗体溶于稳定的蛋白基质中；此试剂使用前需用示踪剂抗体稀释液进行稀释；贮存于2-8℃至有效期
　　
　　示踪抗体稀释液，1瓶，11ml，即用，Trizma盐酸溶于缓冲液；根据实验步骤用于示踪抗体稀释；贮存于2-8℃至有效期
　　
　　试验缓冲液，浓缩，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐；建议使用前以1:10比例用双蒸水稀释（如11ml浓缩+99ml的双蒸水）；贮存于2-8℃至有效期
　　
　　洗涤液，浓缩，1瓶，20ml，30倍浓缩；试验前需用580ml的双蒸水稀释，混匀；一旦稀释，不含叠氮化物防腐剂的磷酸缓冲盐洗涤液会含表面活性剂；稀释的洗涤液在室温下可保存至效期
　　
　　HRP底物液；1瓶，12ml，含过氧化氢的TMB底物液；贮存于2-8℃至有效期
　　
　　终止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，贮存于2-8℃至有效期
　　
　　胎球蛋白A标准品，5瓶，含胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质；各标准品浓度见瓶子标签；3次冻存周期使用后，所有标准品保存至-20℃或更低
　　
　　胎球蛋白A质控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质，各质控的浓度范围见瓶子标签，3次冻存周期使用后质控保存至-20℃或更低
　　
　　安全注意事项
　　
　　此试剂用于临床参考实验室，仅供医生或实验室专业人士体外诊断用
　　
　　若试剂是有潜在感染风险的，试验操作和处理时应戴手套
　　
　　避免接触含TMB，过氧化氢，硫酸的试剂，TM,B会刺激皮肤和粘膜，导致皮肤过敏反应；TMB还可能是致癌物质；皮肤接触到硫酸会导致严重灼伤，不要接触到眼睛，皮肤，衣服，不要吸入烟雾，一旦接触，应立即用大量水冲洗至少15min
　　
　　良好实验室操作规范
　　
　　实验所需材料但试剂盒未提供
　　
　　的单通道移液器，10-25-100-1000ul
　　
　　适于100ul的可重复用分液器
　　
　　适于所有体积的一次性枪头
　　
　　一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
　　
　　带盖的一次性塑料瓶；100-1000ml
　　
　　铝箔纸
　　
　　双蒸水或去离子水
　　
　　塑料盖板或聚乙烯薄膜
　　
　　多通道洗涤瓶或全自动（半自动）洗板系统
　　
　　酶标仪，450nm
　　
　　样本采集
　　
　　人胎球蛋白A的检测所需血清或血浆样本量仅10ul
　　
　　个人在采样前无需特殊准备，全血采集，室温下立即凝集30min，然后离心分离出血清（850-1500xg10min）。全血采集3小时内需将血清从凝集中分离出来，转移至另一干净试管；血清样本可保存在-20℃或更低，避免超过三次的冻融
　　
　　建议采用24小时尿液来检测尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采样前刚进行剧烈运动的，因肾功能不全导致多尿的；由利尿药引起的人体内尿蛋白含量波动降低，可能与尿肌酸酐浓度相关；
　　
　　细胞上清，组织提取物则需进行试验样本的倍比稀释；多个平行样检测得到更的试验结果
　　
　　实验步骤
　　
　　患者样本的准备
　　
　　患者血清或血浆样本在检测前需用试验缓冲液进行1:10000的稀释
　　
　　以1A和1B标记两个试管（12x75mm）
　　
　　加1ml的试验缓冲液至各试管（1A和1B）
　　
　　加10ul的患者血清至1A试管，混合（1:100）
　　
　　从1A管内吸取10ul已稀释的样本至1B试管，混合（1:10000）
　　
　　注意：建议采用/经校准的移液器，稀释过程小心操作，得到更的结果；建议采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重复移液器加1ml的试验缓冲液，而不用50ml的枪头
　　
　　患者尿液样本的实验前用试验缓冲液1:100的稀释
　　
　　以1标记一试管（12x75mm）
　　
　　各管加1ml试验缓冲液
　　
　　加10ul患者尿液样本至1管，混合（1:100）
　　
　　注意：若所得结果中样本浓度高于5个标准品中的zui高标准品浓度，则尿液样本需进一步稀释（如1:500），然后重新检测
　　
　　试剂准备
　　
　　试验前将所有试剂平衡至室温，不同批次的试剂不能混合使用
　　
　　使用前，试验缓冲液（浓缩）及洗涤液（浓缩）需进行稀释，配制成工作液；详情请见“试剂”部分
　　
　　试验操作
　　
　　将实验所需板条固定于板架上，标准品，质控品及未知样本做双孔检测
　　
　　试验布局
　　
　　ROWSTRIP1STRIP2STRIP3
　　
　　ASTD1STD5SAMPLE2
　　
　　BSTD1STD5SAMPLE2
　　
　　CSTD2C1SAMPLE3
　　
　　DSTD2C1SAMPLE3
　　
　　ESTD3C2
　　
　　FSTD3C2
　　
　　GSTD4SAMPLE1
　　
　　HSTD4SAMPLE1
　　
　　加25ul的标准品，质控品及预稀释的1:10000样本至相应孔内；注意：尿液样本是1:100的稀释
　　
　　每孔加100ul的试验缓冲液
　　
　　混匀，盖板，避免暴露于阳光下
　　
　　室温下孵育2小时
　　
　　示踪抗体工作液的准备，示踪抗体1:21的用示踪抗体稀释液稀释；每条板需1ml的示踪抗体稀释液+50ul的胎球蛋白A示踪抗体
　　
　　移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后*吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机
　　
　　以上稀释的示踪抗体工作液加100ul至各孔
　　
　　盖板，避免暴露于阳光下
　　
　　室温下孵育30min
　　
　　移去盖板，弃去孔内反应液，每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次，然后*吸出孔内液体，或可采用全自动洗板机
　　
　　每孔加100ul的ELISAHRP底物液
　　
　　盖板，避免暴露于阳光下
　　
　　室温下孵育20min
　　
　　移去盖板，每孔加100ul的终止液，混匀
　　
　　10min内在450nm酶标仪上检测吸收值
　　
　　注意：为降低背景色，可以双波长检测，设置参考波长：595nm或620nm或630nm
　　
　　操作注意事项
　　
　　建议所有标准品，质控品和未知样本做双孔检测；各双孔检测的吸收均值用于数据处理，结果计算
　　
　　将光敏试剂保持装于原琥珀色瓶内
　　
　　将剩余的包被板条放存在含干燥剂的密封袋内，避免受潮
　　
　　操作严格，移液器经校准可确保试验的可重复性
　　
　　孵育时间或温度也可能会影响试验结果
　　
　　避免微孔内产生气泡，可能会导致结合率低，双孔读数变异系数高
　　
　　使用前所有试剂都应*混匀，避免产生气泡
　　
　　结果说明
　　
　　计算各双孔吸收值均值
　　
　　所有的吸收均值都减去标准品1（即0ng/ml）的吸收均值
　　
　　在点对点或对数-对数坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收均值为Y轴绘制标准曲线；或是采用数据处理软件进行结果计算
　　
　　质控品和样本浓度（1:10000）可直接从标准曲线上读取，若采用的是对数-对数或数据处理软件计算则需用到对数转换；样本校正吸收值在浓度1ng/ml和下一个zui高标准品间的需通过公式计算：
　　
　　未知样本浓度=未知样本吸收值x2nd标准品浓度值