酶联免疫吸附（ ELISA） 法在食品微生物检测中的应用

酶联免疫吸附测定法( Enzyme- Linked lmmunosorbentAssay; 简称ELISA) 是从酶标记抗体技术发展起来的。1966 年, Nakane 和Avrameas 首先用酶标记抗体在普通光学显微镜下定位抗原。1971 年, Engvall 和Perlman 以及Weeman 和Schuurs仿照放射免疫测定法( RIA) 的竞争性测定原理, 使酶标抗原与待测标本中的未标记的抗原, 竞争结合一定量的抗体, 然后分离游离的和结合的标记抗原, 测定酶活性, 即可得到待测抗原量。次年, Engvall等改用酶标记免疫球蛋白, 提高了标记效率,避免了半抗原标记困难的问题, 也简化了操作手续[ 1] 。酶联免疫吸附测定法结合了免疫荧光法和放射免疫测定法两种技术的优点, 具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点
1 ?? 酶联免疫吸附的原理与方法
1. 1 ?? 原理
酶联免疫吸附测定的基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面; 测定时, 将受检样品( 含待测抗体或抗原) 和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物; 反应终止时, 固相载体上酶标抗原或抗体被结合量( 免疫复合物) 即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例; 经洗涤去除反应液中其他物质, 加入酶反应底物后, 底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物, zui后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量[ 2] 。
1. 2 ?? 方法
ELISA 常用的测定方法主要有直接法和间接法两种: 直接法是酶标记抗体与待检测样本中固相抗原直接作用, 加入底物后, 显色( 其颜色深浅与样本中抗原量成正比) ; 间接法是使已知抗原吸附在固相载体上, 与待检测样本中的抗体作用, 再加入酶标记抗同种动物抗体的免疫球蛋白( 抗抗体) , 使与特异抗原抗体复合物中的抗体作用, 加入酶底物, 显色( 颜色深浅与样本中抗体量成正比) [ 1] 。ELISA 有许多改良方法, 如双抗体法( sandwichELISA) 、双抗体夹心法( double_antibody sandwichtechnique) 、竞争法、酶- 抗酶法和均质法( homogeneousELISA) 、生物素- 亲和素放大系统( biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑点_ELISA ( dot_ELISA)等, 大致可分为三类: ( a) 测定抗体的间接法; ( b)测定抗原的双抗体夹心法: ( c) 测定抗原的竞争法[ 3] 。前两种方法主要用于测定抗体和大分子抗原, 适用于临床诊断上, 而竞争法是测定小分子抗原的方法, 因而尤其适用于食品分析。竞争酶联免疫吸附分析法又可分为直接竞争法和间接竞争法。直接竞争法主要有三步: 抗体吸附于固相载体, 温育后清洗?? 加入含有抗原的待测液及酶标记的抗原, 温育后清洗?? 加入酶底物温育后显色, 判断结果。间接竞争法主要有四步: 抗原吸附于固体载体, 温育后清洗??加入含有抗原的待测液和抗体, 温育后清洗?? 加入酶标记抗体, 温育后清洗?? 加入酶底物温育后显色, 判断结果[ 4] 。
1. 3 ?? 操作要点
影响ELISA 测定结果的因素主要包括以下几点:
( 1) 抗原包被的质量。将抗原固定于聚苯乙烯微量反应板中称之为包被, 其效果好坏是影响抗原?? 抗体反应的重要因素;
( 2) 非特异性反应干扰的排除。除了设置稀释液空白、阳性和阴性参比血清等对照外, 可采用包埋、封闭等预处理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白、明胶或吐温- 20 等, 以减少非特异性反应的发生。高选择性的单克隆抗体代替多克隆抗体也是提高ELISA 特异性的另一有效途径[ 3] 。此外, 选择表面积较大的固相载体, 也有利于提高ELISA 的敏感性;(3) 酶和交联剂的选择。用于ELISA 标记的酶, 主要有辣根过氧化氢酶(HRP) 、碱性磷酸酯酶(AKP) 、葡萄糖氧化酶( GO) 和半乳糖苷酶等, 而以HRP 用得较多。酶和抗体交联可用免疫法( 酶-抗酶抗体) 或化学法, 常用化学法。一般来说, HRP与抗体的交联现多采用改良Wilson?? s 法( 高碘酸钠
氧化法) , AKP 与抗体交联通常有戊二醛法和偶氮法[ 3] ;( 4) 酶底物。它本身要求无色, 反应后能稳定呈色。一般HRP 常采用邻苯二胺( 产物桔黄色, 可稳定呈色数小时) 或邻联甲苯胺作酶底物; AKP 常用对硝基苯磷酸盐作酶底物。
2?? 酶联免疫吸附在食品微生物检测中的应用
2. 1 ?? 细菌的检测
检测方法( 薄层层析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色谱法HPLC)进行了对比研究。结果表明直接竞争ELISA 及间接竞争LISA 具有灵敏、特异、简便、快速、安全、价廉等特点, 适合在我国基层推广应用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的单克隆抗体建立了检测食品( 玉米、花生、小麦、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 间接竞争法。该方法zui低检出浓度为0. 0lng/ g, 敏感范围为0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率为83. 0~ 110. 3%, 精密度为2. 0~ 24. 3%。用该法测定了分布于淮河以北地区的1455 份样品, 并对25 份植物油样品用TIC 和ELISA 两种方法进行了对比测定。结果表明, 在方法灵敏度下( 5ng/ g ) TLC 均无AFB1 检出, 而ELISA 法AFB1 检出率为96%, ELISA法的检测灵敏度远高于TLC 法。黄薇等[ 15]( 2002年) 运用ELISA 并使用试剂盒对292 份样品进行了黄曲霉素B1 的检验, 并与薄层法进行了比较。结果表明: 回收率为72% ~ 95% , 变异系数为2. 76% , 与薄层法相比, 该法快速、简便、灵敏、安全。用酶联免疫吸附法检测食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有综述性介绍[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介导的病毒的检测
ELISA 方法一直被用于食品从业人员的甲肝、乙肝病毒感染情况进行调查[ 1. 17- 20] 。黄汉菊, 黄振武等[ 21]( 2001 年) 采用间接酶联免疫吸附法对四川省克山病病区30 例潜、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG进行检测, 了解柯萨奇B 组病毒( CoxB) 感染与克山病的相关关系。表明病区潜、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。应用ELISA 方法, 可将无明显临床症状的海绵状病毒( BSE) 感染动物可被检出, 经对朊蛋白Westem 印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的分析, 证明该方法是有效的。我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、合流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用, 建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术, 已形成试剂盒生产能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物检测中发挥重要作用外, 已有用于有益微生物的检测的报道,如采用间接ELISA 法进行双歧杆菌制剂产品的品质监测[ 7] 。
2. 2 ?? 真菌毒素的检测
刘滨磊等[ 13]( 1990 年) 继李秀芳等( 1987 年) 建立反向直接竞争ELISA 法测定黄曲霉毒素B1(AFBl) 之后, 又建立了直接竞争ELISA、间接竞争ELISA 及生物素?? 亲合素ELISA( BA- ELISA) 三种检测食品中黄曲霉毒素B1 的方法。并将此四种方法进行了比较。另外, 将ELISA 方法与其它AFB1检测方法( 薄层层析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色谱法HPLC)进行了对比研究。结果表明直接竞争ELISA 及间接竞争ELISA 具有灵敏、特异、简便、快速、安全、价廉等特点, 适合在我国基层推广应用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的单克隆抗体建立了检测食品( 玉米、花生、小麦、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 间接竞争法。该方法zui低检出浓度为0. 0lng/ g, 敏感范围为0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率为83. 0~ 110. 3%, 精密度为2. 0~ 24. 3%。用该法测定了分布于淮河以北地区的1455 份样品, 并对25 份植物油样品用TIC 和ELISA 两种方法进行了对比测定。结果表明, 在方法灵敏度下( 5ng/ g ) TLC 均无AFB1 检出, 而ELISA 法AFB1 检出率为96%, ELISA法的检测灵敏度远高于TLC 法。黄薇等[ 15]( 2002年) 运用ELISA 并使用试剂盒对292 份样品进行了黄曲霉素B1 的检验, 并与薄层法进行了比较。结果表明: 回收率为72% ~ 95% , 变异系数为2. 76% , 与薄层法相比, 该法快速、简便、灵敏、安全。用酶联免疫吸附法检测食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有综述性介绍[ 16] 。
2. 3 ?? 食品介导的病毒的检测
ELISA 方法一直被用于食品从业人员的甲肝、乙肝病毒感染情况进行调查[ 1. 17- 20] 。黄汉菊, 黄振武等[ 21]( 2001 年) 采用间接酶联免疫吸附法对四川省克山病病区30 例潜、慢型克山病患者血清中CoxBl ?? 6 ?? IgM 和CoxBl ?? 6 ?? IgG进行检测, 了解柯萨奇B 组病毒( CoxB) 感染与克山病的相关关系。表明病区潜、慢型克山病患者有CoxB 感染存在。应用ELISA 方法, 可将无明显临床症状的海绵状病毒( BSE) 感染动物可被检出, 经对朊蛋白Westem 印迹法检测牛及羊朊病毒蛋白的分析, 证明该方法是有效的。我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、合流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用, 建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术, 已形成试剂盒生产能力[ 6] 。ELISA 法除了在上述食品微生物检测中发挥重要作用外, 已有用于有益微生物的检测的报道,如采用间接ELISA 法进行双歧杆菌制剂产品的品质监测[ 7]

3 ?? 结语
自从上世纪60、70 年代ELISA 技术建立以来,无论是该方法本身的改进方面, 还是其应用领域的拓展方面都有了很大的进步, 包括试剂的灵敏性、稳定性和通用性的增强, 自动检测仪器的开发, 以简捷、灵敏和微量化的情况下, ELISA 技术较之其它方法显示了很大的优势。但同时它也不可避免地存在着一些缺陷, 如存在交叉反应, 对试剂的选择性高, 难于同时分析多种成分等。随着有关研究和探索的不断深入, 可以相信ELISA 技术在食品微生物检测中将会发挥更为重要的作用。