牛纤维素酶（ CE）酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 96T
10U/L –320U/L
使用目的：
本试剂盒用于测定牛粪便样本中纤维素酶（ CE）的含量。实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛纤维素酶（ CE）水平。用纯化的牛纤维素酶（CE）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入纤维素酶（ CE），再与 HRP标记的纤维素酶（ CE）抗体结合，形成抗体 -抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB显色。 TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的纤维素酶（ CE）呈正相关。用酶标仪在 450nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中牛纤维素酶（ CE）浓度。试剂盒组成
| 1 | 30倍浓缩洗涤液 | 20ml×1瓶 | 7 | 终止液 | 6ml×1瓶 | | 2 | 酶标试剂 | 6ml×1瓶 | 8 | 标准品（ 640U/L） | 0.5ml×1瓶 | | 3 | 酶标包被板 | 12孔 × 8条 | 9 | 标准品稀释液 | 1.5ml×1瓶 | | 4 | 样品稀释液 | 6ml×1瓶 | 10 | 说明书 | 1份 | | 5 | 显色剂 A液 | 6ml×1瓶 | 11 | 封板膜 | 2张 | | 6 | 显色剂 B液 | 6ml×1/瓶 | 12 | 密封袋 | 1个 | |
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于 -20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因 NaN3抑制辣根过氧化物酶的（ HRP）活性。
标本收集方法：
1. 血清：
室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
2. 血浆：
应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清
。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
3. 尿液：
用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参
照此实行。
4. 细胞培养上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
5. 培养细胞
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试
剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离
心。
6. 组织标本
切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量
的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分
装后一份待检测，其余冷冻备用。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl，
然后再加待测样品 10µl（样品zui终稀释度为 5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置 37℃温育 3 0分钟。
4.配液：将 30倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同 3。
8.洗涤：操作同 5。
9.显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀， 37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零， 450nm波长依序测量各孔的吸光度（ OD值）。测定应在加终止
| 320U/L | 5号标准品 | 150µl的原倍标准品加入 150µl标准品稀释液 | | 160U/L | 4号标准品 | 150µl的 5号标准品加入 150µl标准品稀释液 | | 80U/L | 3号标准品 | 150µl的 4号标准品加入 150µl标准品稀释液 | | 40U/L | 2号标准品 | 150µl的 3号标准品加入 150µl标准品稀释液 | | 20U/L | 1号标准品 | 150µl的 2号标准品加入 150µl标准品稀释液 | |
液后 15分钟以内进行。操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标， OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的 OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在 5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD值大于标准品孔*孔的 OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（ n倍）后再测定，计算时请zui后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 .
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期： 6个月
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